برو بالا

مجموعه مقالات پایان نامه لونا پروژه

بررسی قابلیت ترکیب‌پذیری عمومی و خصوصی برای صفت عملکرد در ده ایزوله خالص هموکاریون قارچ خوراکی تکمه‌ای سفید

نوشته شده در آبان ۸, ۱۳۹۵ | 51 views

عنوان                                                                                                                          صفحه
چکیده——————————————————————— ۱
فصل اول: مقدمه

دلایل عمده عملکرد پایین قارچ خوراکی تکمه‌ای سفید در ایران ———————– ۸
فصل دوم: بررسی منابع

تاریخچه پرورش قارچ خوراکی تکمه‌ای سفید ————————————– ۱۰

آشنایی اجمالی با قارچ خوراکی تکمه‌ای سفید ————————————- ۱۲

طبقه‌بندی —————————————————————— ۱۲

رده بندی —————————————————————— ۱۲

اندام شناسی قارچ خوراکی تکمه‌ای سفید —————————————- ۱۳

مشخصات پرگنه در کشت خالص ———————————————– ۱۵

نامگذاری علمی قارچ خوراکی تکمه‌ای سفید:————————————— ۱۵

تقسیم بندی واحدهای سلولی میسلیوم از لحاظ تعداد و ترکیب‌بندی هسته‌ای ———– ۱۶

‌چرخ زندگی قارچ خوراکی تکمه‌ای سفید —————————————– ۱۶
بررسی الگوهای چرخه زندگی در قارچ خوراکی تکمه‌ای سفید ——————– ۱۹

الف ـ هموتالیسم —————————————————— ۱۹

ب ـ هتروتالیسم —————————————————— ۲۰
ژنتیک قارچ خوراکی تکمه‌ای سفید ——————————————— ۲۲

روشهای بهبود نژادی در قارچ خوراکی تکمه‌ای سفید:——————————– ۲۴

الف

کشت بافت —————————————————————– ۲۵
گزینش از طریق کشت تک اسپوری———————————— ۲۶
تهیه نقش اسپور ————————————————————- ۲۶

الف ـ کشت و گزینش تک اسپوری ————————————— ۲۶

ب ـ کشت و گزینش چند اسپوری ————————————— ۲۷

اختلاط ساده—————————————————————- ۲۸

تلاقی هدفمند هموکاریون‌ها—————————————————- ۲۸
بدست آوردن هموکاریون و تایید آنها———————————– ۲۹

۱ـ روش سنتی تأیید هموکاریون‌ها—————————————- ۲۹

۲ـ تهیه و تایید هموکاریونهای والدی به روش تهیه پروتوپلاست —————- ۳۰

۳ـ تایید هموکاریونها با استفاده از نشانگر RFLP—————————— 30

۴ـ تایید هموکاریون‌ها با استفاده از نشانگر RAPD —————————- 31
انجام تلاقی بین هموکاریونها و تایید هیبریدها: —————————– ۳۲

الف ـ استفاده از نشانگرهای غذایی برای تایید هیبریدها:———————– ۳۳

ب ـ استفاده از آیزوزایم‌ها برای تایید هیبریدها: —————————– ۳۴

ج ـ استفاده از نشانگرهای مقاومت برای تأیید هیبرید‌ها———————— ۳۴

اصلاح برخی صفات با استفاده از روش تلاقی هیبریدها: —————————— ۳۴
د ـ استفاده از نشانگرهای مورفولوژیکی برای تایید هیبریدها: ——————- ۳۵
مراحل انجام آزمون اصلاحی از طریق دورگ‌گیری هدفمند: ——————— ۳۵

۱ـ کشت اسپور——————————————————- ۳۵

۲ـ جداسازی تک اسپورها ———————————————- ۳۶

۳ـ تهیه اسپاون ——————————————————- ۳۶
آزمون میوه‌دهی ———————————————— ۳۶
الف ـ تهیه بستر کشت: ———————————————— ۳۶

ب ـ مراحل پرورش و میوه‌دهی: —————————————— ۳۷

تولید پریموردیا در سطح محیط کشت: ——————————————- ۳۸

تولید اجسام میوه دهی در اسپاون———————————————– ۳۸

‌ج ـ تولید اندام باردهی در کمپوست————————————— ۳۹
مهندسی ژنتیک———————————————— ۳۹

۱ـ انتقال ژن ——————————————————— ۳۹

۲ـ اختلاط پروتوپلاستها———————————————— ۴۰
فصل سوم: مواد و روشها

تهیه نژادها —————————————————————– ۴۲

روش تهیه محیط کشت غذایی PDA———————————————- 42

روش کشت هموکاریون‌ها —————————————————— ۴۳

روش تلاقی هموکاریون‌ها——————————————————- ۴۴

نمونه‌گیری از منطقه تلاقی —————————————————- ۴۵

تهیه اسپاون مادری از هیبریدها————————————————- ۴۵

تلقیح دانه‌های گندم با کشت هیبرید——————————————— ۴۶
تهیه بستر کشت (کمپوست)—————————————- ۴۷

الف ـ پاستوریزاسیون و آمونیاک‌زدایی ————————————- ۴۹

ب ـ مایه‌زنی کمپوست ————————————————- ۴۹

ج ـ خاک‌دهی بستر کشت———————————————– ۴۹

هوادهی و افت سریع دما——————————————————- ۵۰

محاسبه قابلیت ترکیب‌پذیری عمومی و خصوصی ———————————– ۵۳

محاسبه واریانس ترکیب‌ پذیریی عمومی و خصوصی——————————— ۵۳

محاسبه واریانس  افزایشی و غالبیت———————————————- ۵۳
فصل چهارم نتایج و بحث

نتایج بررسی سرعت رشد (قطر پرگنه هموکاریون‌ها)——————————— ۵۵

تیپ رشدی پرگنه هموکاریون ————————————————– ۵۵

نتایج سرعت رشد در هتروکاریو‌ن‌ها ———————————————- ۵۹

نتایج مشاهده‌ای تهیه اسپاون ————————————————— ۶۰

نتایج مشاهدای آزمون میوه‌دهی ———————————————— ۶۰

جدول تجزیه واریانس برای صفت عملکرد در دورگ‌ها ——————————- ۶۱

جدول قابلیت ترکیب‌پذیری عمومی در هموکاریون‌ها ——————————– ۶۴

جدول قابلیت ترکیب‌پذیری خصوصی دورگ‌ها ————————————- ۶۴

جدول مقادیر اجزاء ژنتیکی —————————————————- ۶۶

ضریب همبستگی ———————————————————— ۶۶
پیشنهادات —————————————————————– ۶۷

منابع ———————————————————————- ۶۹

پیوست——————————————————————— ۷۵

چکیده انگلیسی ————————————————————- ۷۸

امروزه تأمین غذا و بویژه پروتئین در کشورهای در حال توسعه به یکی از مسائل بنیادی تبدیل شده است. پروتئین مورد نیاز انسان از دو منبع اساسی شامل منابع حیوانی و دیگری منابع گیاهی قابل تأمین است. پروتئین گیاهی شامل حبوبات، غلات و میوه‌جات و سبزیجات است و پروتئین حیوانی عمدتاً شامل گوشت دامها، طیور، آبزیان و فراورده‌های لبنی و دامی می‌باشد. در ایران، کمبود میزان بارش سالیانه، تخریب اراضی کشاورزی، جنگلها و مراتع، آلودگی بیش از حد منابع آبی، عدم استفاده صحیح و اصولی از نهاده‌های زراعی و مهمتر از همه سوء مدیریت، باعث مشکلات زیادی در تأمین پروتئین شده است. هم اکنون کشور ما بیش از ۶۵ میلیون جمعیت دارد و پیش‌بینی می‌شود تا سال ۱۴۰۰ هجری شمسی این رقم به۸۰ میلیون نفر برسد. با افزایش روزافزون جمعیت و تغییر الگوی مصرف مقدار غذای سرانه و مصرف کل غذا افزایش خواهد یافت. با توجه به مشکلات فوق، در آینده یکی از بحرانی‌ترین مسائل کشور ما، مسئله تأمین پروتئین خواهد بود. در این میان تولید و پرورش قارچ خوراکی از چند نظر حائز اهمیت است، که عبارتند از:
۱ـ تأثیر اندک شرایط محیطی و آب و هوایی بر پرورش قارچ خوراکی:
قارچ خوراکی در بیشتر مناطق آب و هوایی کشور بدون تجهیزات و امکانات ویژه قابل پرورش است. زیرا تولید و پرورش آن در مکان‌های کنترل شده و سربسته صورت می‌گیرد. همچنین پرورش قارچ از لحاظ صرفه‌جویی در استفاده از زمین، قابل توجه می‌باشد.
۲ـ صرفه اقتصادی:
برای تولید و پرورش قارچ خوراکی از بقایای گیاهی محصولات کشاورزی از قبیل کاه و کلش و سایر مواد زاید گیاهی استفاده می‌شود و نیز کمپوست مصرف شده در پرورش قارچ، می‌تواند به عنوان کود آلی مرغوب در باغها و مراتع مورد استفاده قرار گیرد. از سوی دیگر تهیه منابع پروتئینی دیگر، در مقایسه با قارچ، هزینه بشتری دارد.
۳ـ ارزش غذایی:
قارچ خوراکی با میزان پروتئین ۳۰ـ۲۵ درصدی هم‌ردیف حبوبات و بالاتر از سبزیجات و میوه‌ها قرار دارد. همچنین هضم ۸۰ـ۷۰ درصدی پروتئین قارچ حائز اهمیت است و میزان کربوهیدرات‌ها و کلسترول در آن پایین است. به دلیلی پایین بودن کالری در قارچ یک رژیم غذایی مناسب برای لاغری است. قارچ‌های خوراکی دارای ترکیبات ضدسرطان نیز می‌باشند. با مصرف قارچ‌های خوراکی می‌توان ویتامین‌های C,E,K,D,A و گروه (B6, B2, B1) B و املاح معدنی مانند پتاسیم، کلسیم، فسفر و مقادیری آهن مورد نیاز بدن را تأمین کرد. برخی از اسیدهای آمینه در قارچ‌ خوراکی شامل لیزین، تریپتوفان، تریپسین و اسید فولیک می‌باشد (محمدی گل تپه، ۱۳۷۹).
همچنین مقایسه برخی از اسیدآمینه‌های موجود در قارچ خوراکی تکمه‌ای سفید با تخم‌مرغ، که یک منبع غذایی غنی از پروتئین می‌باشد، در جدول ۲ آمده است (چنگ و مایلز، ۱۹۸۹) .

جدول ۱ـ ارزش غذایی قارچ خوراکی تازه به شرح جدول زیر می‌باشد (غلامعلی پیوست، ۱۳۷۵).
درصـد    مـاده
۵/۹۰ـ۳/۷۸    آب
۳۰ـ۲۵    پروتئین (وزن خشک)
۵/۳    پروتئین (وزن تر)
۸ـ۷/۱    چربی (وزن خشک)
۳/۰ـ۲/۰    چربی (وزن تر)
۱ـ۸/۰    نمکهای معدنی
۱۲ـ۷/۷    خاکستر (وزن خشک)
۳۶۸ـ۳۲۸    انرژی (k cal در ۱۰۰ گرم)

جدول ۲ـ مقایسه برخی از اسیدهای آمینه موجود در قارچ خوراکی تکمه‌ای سفید با تخم‌مرغ:  (در ۱۰۰ گرم پروتئین)
قارچ تکمه‌ای سفید    تخم‌مرغ    اسید آمینه
۵/۷    ۸/۸    لوسین
۵/۴    ۶/۶    ایزولوسین
۵/۲    ۳/۷    والین
۲    ۶/۱    تریپتوفان
۱/۹    ۴/۶    لیزین
۲/۴    ۸/۵    فنیل آلانین
۹/۰    ۱/۳    متیونین

۴ـ اشتغال‌زایی:
چنانچه در زمینه ترویج، توسعه و حمایت از پرورش قارچ خوراکی در مناطق مختلف کشور بخصوص روستاها فعالیت شود، می‌توان علاوه بر تأمین مواد غذایی گام مؤثری در جهت ایجاد اشتغال جنبی مناسب و افزایش درآمد کشاورزان برداشت.
در بین قارچهای خوراکی، قارچ تکمه‌ای سفید رایج‌ترین قارچی است که در سراسر جهان کشت می‌شود. پرورش قارچ خوراکی تکمه‌ای سفید در اواسط قرن هفدهم میلادی در فرانسه شروع شده و از دهه ۱۹۶۰ تولید آن به صورت صنعت بزرگی، درآمده است. در مجموع به طور متوسط قارچ خوراکی تکمه‌ای سفید ۳۸ درصد کل تولید قارچ خوراکی در دنیا را، به خود اختصاص داده است
(دفتر امور  گل و گیاهان زینتی و قارچ‌های خوراکی وزارت جهاد کشاورزی، ۱۳۸۲).
علیرغم اهمیت اقتصادی و تجاری قارچ خوراکی تکمه‌ای سفید، برنامه اصلاحی برای بهبود عملکرد آن، با مشکلاتی همراه است. یکی از مهم‌ترین مشکلات، به چرخه نامعمول زندگی این قارچ برمی‌گردد که غالباً بجای تشکیل بازیدیوسپورهای تک هسته‌‌ای،  بازیدیوسپورهایی حاوی دو هسته هاپلوئید متفاوت و سازگار از نظر جنسی، تولید می‌کند (استوپ و مایبروک، ۱۹۹۹) . مشکل دیگر، عدم وجود اختلافات مورفولوژیکی قابل مشاهده، بین میسلیوم‌های با منشأ تک اسپوری و چند اسپوری می‌باشد (کریگان، ۱۹۹۲) .  همچنین از نظر تندش اسپور، که به عنوان اولین گام در یک برنامه اصلاحی است، بسیار ضعیف و ناهماهنگ است (چنگ و مایلز، ۱۹۸۹) . از دهه ۱۹۷۰ میلادی، الگوی جنسی و چرخه کامل زندگی این قارچ به دقت مورد مطالعه قرار گرفته است. متوسط سرانه مصرف قارچ خوراکی در دنیا، در حدود ۵/۲ کیلوگرم است در حالی که این میزان در ایران، تنها ۱۶۰ گرم است و متوسط سرانه مصرف قارچ خوراکی در ایالات متحد امریکا حدود یک کیلوگرم می‌باشد. میزان تولید سالیانه قارچ خوراکی تکمه‌ای سفید در آلمان، در سال ۱۹۵۹، حدود ۵۱۰۰ تن و در سال ۱۹۶۵، حدود ۹۰۰۰ تن و در سال ۱۹۶۷، به مرز ۱۵۰۰۰ تن رسید در سال ۱۹۶۹ ارزش نقدی تولید جهانی این قارچ از مرز یک میلیارد مارک گذشته بود (غلامعلی پیوست، ۱۳۷۵).
میزان تولید سالیانه قارچ خوراکی در ایران، در حدود۱۲ هزار تن است که از این میزان، حدود ۱۰ هزار تن به قارچ تکمه‌ای سفید اختصاص دارد. حدود صد واحد تولیدی فعال و نیمه فعال قارچ خوراکی تکمه‌ای سفید، در ایران شناسایی شده‌اند. گرچه آمار و ارقام دقیق و قابل اعتمادی از میزان عملکرد قارچ خوراکی در ایران در دست نیست، ولی براساس شواهد موجود، عملکرد در ایران، حدود ۱۲ کیلوگرم در مترمربع است، در حالیکه متوسط عملکرد جهانی قارچ خوراکی تکمه‌ای سفید، در حدود ۲۵ کیلوگرم در مترمربع می‌باشد (دفتر امور گل و گیاهان زینتی و قارچهای خوراکی وزارت جهاد کشاورزی، ۱۳۸۲).
طبق آمار موجود، کشورهای تولیدکننده قارچ خوراکی تکمه‌ای سفید در جدول ۳و۴  آمده‌اند.

جدول ۳ـ کشورهای تولید کننده قارچ خوراکی تکمه‌ای سفید در سال ۱۹۸۴
تولید قارچ تکمه‌ای سفید (هزار تن)    کشور
۸۷۵    اروپا
۴۲۵    آمریکای شمالی
۳۳۰    چین
۶۸    آسیا
۵۱    آمریکای لاتین
جدول ۴ـ کشورهای تولید کننده قارچ خوراکی تکمه‌ای سفید در سال ۱۹۹۷
تولید قارچ تکمه‌ای سفید (هزار تن)    کشور
۲۴۶    ایالات متحده آمریکا
۱۶۰    فرانسه
۱۴۰    چین
۹۰    هلند
۸۴    انگلستان

به علت نبود مراکز تحقیقاتی در ایران و عدم توجه کافی مراکز علمی و دانشگاهی کشور به این تکنولوژی سودآور و پرمنفعت، پرورش قارچ خوراکی نتوانسته جایگاه واقعی خود را پیدا کند علاوه بر این بی‌توجهی مراکز تحقیقات کشاورزی موجب عدم تربیت نیروی متخصص لازم و کافی برای پرورش و تولید قارچ خوراکی شده است.

دلایل عمده عملکرد پایین قارچ خوراکی تکمه‌ای سفید در ایران:
۱ـ عدم تهیه یک بستر کشت مناسب
تهیه و آماده‌سازی بستر کشت، (کمپوست) از مهم‌ترین مراحل پرورش قارچ خوراکی است، زیرا تغذیه قارچ خوراکی از بستر کشت تأمین می‌شود و قارچ خوراکی تکمه‌ای سفید، یک تجزیه کننده ثانویه می‌باشد و از اجساد میکروارگانیسم‌های موجود در کمپوست نیز استفاده می‌کند.
۲ـ عدم رعایت بهداشت محیط
۳ـ عدم کنترل دقیق شرایط محیطی، در زمان پرورش قارچ
۴ـ ضعف بنیه نژادی
استفاده پیاپی و تکثیر رویشی اسپاون با همان روشهای قدیمی، منجر به ضعیف شدن قدرت رویشی اسپاون و کاهش شدید عملکرد آن، شده است. اسپاون وارداتی با زیر کشت‌های متوالی، ضعیف می‌شود. همچنین ممکن است اسپاون وارداتی نامرغوب باشد، لذا تولید اسپاون مرغوب در داخل کشور، امری ضروری است. در همین راستا از حدود هفت سال پیش، تحقیقات در زمینه تولید اسپاون هیبرید، در دانشکده کشاورزی (گروه بیوتکنولوژی) دانشگاه فردوسی مشهد، آغاز شده است.

تاریخچه پرورش قارچ خوراکی تکمه‌ای سفید:
کشت قارچ تکمه‌ای سفید، در قرن هفدهم میلادی در حومه پاریس بوسیله باغبانان فرانسوی در هوای آزاد، صورت گرفت، با کشف این نکته، که وجود نور برای رشد این قارچ، ضروری نیست و در تاریکی هم می‌توانند رشد نمایند. در اوایل قرن نوزدهم کشت و پرورش قارچ، در غارهای طبیعی، معادن و تونلهای حفر شده در فرانسه، توسعه زیادی پیدا کرد. کشت و پرورش قارچ، در اوایل نیمه دوم قرن ۱۹ از اروپا به ایالات متحده امریکا سرایت کرد و در سال ۱۸۹۰، مزرعه‌داران ایالت پنسیلوانیای امریکا، به پرورش قارچ در فضاهای سرپوشیده اشتغال ورزیدند. این کار به سرعت در سایر مناطق رایج شده و متعاقب آن سالنهای ویژه‌ای برای پرورش قارچ خوراکی احداث شد
(سینگر و هریس، ۱۹۸۷)  .
با گسترش علم زیست‌شناسی و اختراع و پیشرفت میکروسکوپ و روشهای میکروبیولوژیکی کاشت و پرورش قارچهای خوراکی، توجه دانشمندان به این موضوع بیشتر جلب شد. در سال ۱۸۸۴ دانشمندانی از جمله مارچوت و کنستانتین، موفق به تولید اسپاون استریل، توسط جوانه زنی توده اسپورهای این قارچ، در شرایط آزمایشگاهی شدند. در سال ۱۹۰۵ داگر موفق به تهیه اسپاون قارچ تکمه‌ای گردید و مطالعات خود را برای تهیه بذر خالص قارچ، از کشت بافت منتشر کرد و بدین ترتیب اولین گام در اصلاح قارچ تکمه‌ای، برداشته شد. از سال ۱۹۱۰ به بعد، کشت و تولید این قارچ در گلخانه‌ و محیط‌های کنترل شده رواج پیدا کرد. در سال ۱۹۲۰، کشاورزان اروپایی، به علت تغییر وسائل نقلیه از اسب به ماشین، به فکر تهیه کمپوست از منابع جدید، (کاه و کلش و کود مرغ) به جای کمپوست اسبی افتادند. لامبرت از ایالات متحده امریکا، اساس تکنولوژی نوین امروزی پرورش قارچ خوراکی را، بنیان نهاد. وی در سال ۱۹۳۲ تهیه بذر قارچ بر روی غلات را ابداع نمود (لامبرت، ۱۹۳۲). انقلاب صنعتی که سیندر طی سالهای ۱۹۳۸ تا ۱۹۴۶ در تهیه کمپوست مصنوعی، برای صنعت پرورش قارچهای خوراکی بوجود آورد، در واقع، دومین قدم در اصلاح این قارچ بوده است (سیندر، ۱۹۳۸) . بنا به گزارش پاتاک و همکاران، از دهه ۱۹۶۰، توسعه تولید و پرورش قارچ خوراکی بویژه تکمه‌ای سفید، به شیوه مدرن، در اکثر کشورها، بویژه در ایالات متحده امریکا آغاز گردید (پاتاک و همکاران، ۱۹۶۰) . در اواخر دهه ۱۹۷۰ و اوایل دهه ۱۹۸۰ فریش، طی یک برنامه اصلاحی بلندمدت، موفق به گزینش و معرفی نژادهای U1 و U3 گردید، که نقطه عطفی در اصلاح قارچ مذکور است (فریش، ۱۹۸۳) .
در ایران، از سال ۱۳۷۶ نخستین گامهای اصلاحی، برای بهبود نژادی قارچ خوراکی تکمه‌ای سفید، در دانشکده کشاورزی مشهد برداشته شده است. طی سالهای ۷۹ـ۱۳۷۷ نخستین فرایند اصلاحی با بهینه‌سازی شرایط کشت تک اسپور، آغاز شد (گردان، ۱۳۷۹). در سال‌های ۸۲ـ۱۳۸۰ با بهینه سازی شناخت هموکاریونها، با استفاده از نشانگر ملکولی RAPD گامی مؤثر، در جهت تسریع فرایند اصلاحی قارچ تکمه‌ای سفید، برداشته شد (کاووسی، ۱۳۸۲).
در سالهای ۸۳ـ۱۳۸۱ شاخصه‌های اصلاحی بر عملکرد قارچ خوراکی تکه‌‌ای سفید، مورد بررسی قرار گرفت (خاتمی، ۱۳۸۳). در این تحقیق که از سال ۱۳۸۲ آغاز شده است، به بررسی قابلیت ترکیب پذیری عمومی و خصوصی در ده ایزوله خالص هموکاریون پرداخته شده است، تا در نهایت بتوانیم بهترین ایزوله هموکاریون برای ترکیب با سایر هموکاریونها را بشناسیم و همچنین، از بین تمامی تلاقی‌های دو به دو بدست آمده، بهترین دورگ با بیشترین عملکرد را، معرفی کنیم. امید است، نتایج حاصل از این تحقیق گامی در جهت پیشبرد اصلاح این قارچ، باشد.

آشنایی اجمالی با قارچ خوراکی تکمه‌ای سفید:
قارچ خوراکی تکمه‌ای سفید با نام علمی Agaricus bisporus و نام انگلیسی
The White Button Mushroom شناخته می‌شود.
طبقه‌بندی:
کلیه موجوداتی که قارچ نامیده می‌شوند، در سه سلسله جداگانه قرار می‌گیرند
(جان و همکاران، ۱۹۹۶) .
۱ـ سلسله Fungi            ۲ـ سلسله Stramenopila         ۳ـ سلسله Protista
قارچ خوراکی تکمه‌ای سفید، یک قارچ عالی، متعلق به سلسله Fungi است.
رده بندی:
سلسله: Fungi
شاخه: Basidiomycota
رده: Hymenomycete
راسته: Agaricale
خانواده: Agaricacea
جنس: Agaricus
گونه:Bisporus
قارچها، فاقد کلروفیل هستند و برای بقاء خود، متکی به وجود مواد آلی هستند، یعنی به اصطلاح، هترو تروف  می‌باشند.
چنانچه مواد آلی مورد نیاز قارچها فقط از گیاهان  مرده جذب گردد، به آنها، گندرو  می‌گویند. قارچ خوراکی تکمه‌ای سفید فقط از بقایای گیاهان تغذیه می‌کند، بنابراین یک قارچ گندرو می‌باشد (جان و همکاران، ۱۹۹۶) .
اصطلاح Mushroom به اندام گوشتی تولید کننده اسپور قارچها، اطلاق می‌شود و می‌توان گفت که ماشرومها خوراکی  یا سمی  هستند. در شاخه Basidiomycota قارچهای خوراکی جنس Agaricus، Pleurotus، Volvariella و Lentinus بیشتر مورد توجه هستند.

اندام شناسی قارچ خوراکی تکمه‌ای سفید:
اصطلاح تکمه‌ای از شکل ظاهری این قارچ در هنگام جوانی، گرفته شده است. هرچند که این مرحله ناپایدار است و قارچ در مرحله بلوغ، به حالتی چتری در می‌آید. به طور کلی یک قارچ خوراکی تکمه‌ای سفید، از دو قسمت عمده تشکیل شده است. قسمت چتری که به صورت کلاهک  پهن است و قسمت دوم، پایه  که کلاهک را نگه می‌دارد (گوپتا، ۱۹۸۸) . پایه قارچ دو وظیفه را عهده‌دار است. اولاً، کاملاً توپر است تا بتواند کلاهک را، محکم نگه دارد. ثانیاً، کلاهک قارچ را، از سطح زمین بالا برده، به طوریکه اسپورها شانس مناسبی برای قرارگرفتن در جریان هوا داشته باشند و موقعیت مناسب و مؤثری برای پراکنده شدن اسپورها، ایجاد سازد (اینگلد، ۱۹۹۶) .
اسپورها بر روی تیغه‌ها قرار دارند و تیغه‌ها در سطح زیرین کلاهک جای دارند. در هنگام جوانی، کلاهک قارچ توسط یک غشاء  که بین کلاهک و پایه تشکیل می‌شود پوشیده شده است این غشاء پس از پاره شدن، اطراف پایه را فرا می‌گیرد که حلقه  نامیده می‌شود. در قارچ A.bisporus ، کلاهک به رنگ سفید، کرم یا قهوه‌ای رنگ و تقریباً صاف و نرم و در بعضی موارد، دارای پولک‌های کوچک است. سطح کلاهک در این قارچ، محدب است که در نهایت کاملاً پهن و گوشتی می‌شود. پایه به صورت مرکزی، سفید و استوانه‌ای و محکم است که در قسمت تحتانی آن ضخیم‌تر بوده و به تدریج که به سمت بالا می‌آید باریک‌تر می‌شود. وسیله تکثیر این قارچ، اسپور است که در حقیقت، همان بازیدیوسپورها  هستند. بازیدیوسپورها در سطح خارجی تیغه‌های  کلاهک به صورت یک لایه به نام هیمینیوم  تشکیل می‌شوند. بازیدیومها سلولهایی هستند که، بازیدیوسپورها بر روی آنها قرار دارند (جندرز، ۱۹۸۲)

مشخصات پرگنه در کشت خالص:
پرگنه یا کلنی ، توده میسلیومی رشد یافته است و می‌توان، آن را در محیط کشت غذایی به اشکال مختلف رشته‌ای، پنبه‌ای، نمدی و بدون میسلیوم هوایی مشاهده نمود. میسلیوم‌ها ضمن رشد انتهایی، انشعابات متعدد نیز تولید می‌کنند، که مطلوب‌ترین شکل رشد میسلیوم‌ها به صورت رشته‌ای و دارای میسلیوم هوایی است، که این موضوع در عملکرد قارچ حائز اهمیت است (لامبرت و همکاران، ۱۹۸۳)  مشاهده شده است که برخی از نژادهای این قارچ، پرگنه خاکستری مایل به سفید و میسلیوم هوایی کمتری تولید می‌کنند و گروهی دیگر، میسلیوم هوایی زیاد تولید کرده و شکل پنبه‌ای به خود می‌گیرند (کلیگمن، ۱۹۴۳)

نامگذاری علمی قارچ خوراکی تکمه‌ای سفید:
این قارچ در منابع مختلف به نامهای متعددی ذکر شده است در اولین کتبی که در مورد پرورش این قارچ منتشر شده، از این قارچ به نام Psalliota campestis نام برده شده است. البته این نام به علت نداشتن اساس تاکسونومیکی مورد پذیرش قرار نگرفته است.
در سال ۱۹۴۵ در کنگره بین‌المللی گیاهشناسی پاریس، نام علمی قارچ تکمه‌ای سفید A.bisporus (Lange) Impach انتخاب شد (سینگر و هریس، ۱۹۸۷)  ولی نام A.bisporus متداول‌تر است. نام‌ معادل دیگر این قارچ peck A.brunnescens است. (بارتون، ۱۹۸۸)

تقسیم‌بندی واحدهای سلولی میسلیوم از لحاظ تعداد و ترکیب‌بندی هسته‌ای:
هموکاریون : به معنای جورهسته‌ای بودن است و به میسلیوم‌هایی که هسته‌هایی از یک ژنوتیپ منفرد دارند، گفته می‌شود. سلولهای میسلیوم در هموکاریون‌ها یا چندهسته‌ای هستند یا تک هسته‌اند که در حالت تک هسته‌ای، به آن مونوکاریون گفته می‌شود. در قارچ تکمه‌ای سفید، هموکاریون‌ها در هر واحد سلولی، چند هسته دارند ولی در اکثر قارچ‌های خوراکی دیگر، سلول‌ها حاوی یک هسته‌اند.
هتروکاریون : به معنای ناجور هسته‌ای بودن است و به میسلیومهایی که دارای هسته‌هایی با دو یا چند ژنوتیپ متفاوت و سازگار هستند، گفته می‌شود. این میسلیوم‌ها قادر به تولید اندام باردهی هستند (سینگر و هریس، ۱۹۸۷).
دای کاریون : هنگامی که دو هیف ناشی از دو مونوکاریون، با تیپ آمیزشی متفاوت، تلاقی می‌یابند، میسلیومی بوجود می‌آید که سلولهای آن هر کدام دو هسته متفاوت و سازگار دارند. به این میسلیوم که نوعی هتروکاریون است، دای‌کاریون گفته می‌شود. (سینگر و هریس، ۱۹۸۷)

چرخه زندگی قارچ خوراکی تکمه‌ای سفید:
چنانچه بازیدیوسپورها در شرایط مناسب قرار گیرند تندش (جوانه زنی) کرده و از آنها رشته‌های نازکی خارج می‌شود، که هیف نام دارد. این هیفها به سرعت رشد کرده و دارای دیواره عرضی می‌شوند و تولید یک شبکه هیفی به نام میسلیوم می‌کنند. این قسمت، اندام رویشی قارچ را تشکیل می‌دهد. در شرایط مناسب قارچ وارد دوره جنسی می‌شود و تولید بازیدیوکارپ می‌کند بازیدیوکارپ، همان اندام خوراکی قارچ را شامل می‌شود. هنگامی که قارچ به مرحله بلوغ رسید، پرده بین کلاهک و پایه که قبلاً قسمت زیر کلاهک را پوشانده است، پاره شده و کلاهک پهن می‌شود. سپس زمانیکه کلاهک قارچ به بلوغ رسید، تیغه‌ها نیز در آن تشکیل می‌شوند. تیغه‌ها در ابتدا به صورت کم رنگ هستند که به تدریج به رنگ قهوه‌ای شکلاتی در می‌آیند. این پدیده به وسیله تعداد زیادی بازیدیوسپور قهوه‌ای رنگ که برروی بازیدیوم‌ها ساخته می‌شوند ایجاد می‌گردد. بازیدیوسپورهای قارچ A.bisporus بسیار کوچک (قطر ۹ـ۸ میکرون) و خیلی سبک هستند شکل آنها عموماً بیضوی است. بازیدیومها، سلولهایی هستند که بازیدیوسپورها بر روی آنها قرار می‌گیرند. هر بازیدیوم دارای دو اندام خار مانند به نام استریگما است که در انتهای هر یک از آنها یک بازیدیوسپور بوجود می‌آید (سوننبرگ، ۲۰۰۰).
در میسلیوم رویشی، هر سلول چند هسته‌ دارد و هسته‌ها هاپلوئید هستند. در زمان تولید اسپور دو هسته متفاوت از نظر تیپ آمیزشی ولی سازگار در سلولهای انتهای هیمینیوم، از سایر هسته‌ها جدا می‌شوند این دو هسته به هم ملحق شده و تولید یک مرحله دیپلوئید ناپایدار می‌کنند سپس وقوع میوز، منجر به تولید چهار هسته می‌شود در بازیدیوم‌هایی که چهار اسپور تولید می‌کنند، یک هسته میوزی هاپلوئید به درون هر اسپور وارد می‌شود، اما در بازیدیوم‌هایی که دو اسپور تولید می‌کنند، دو هسته میوزی هاپلوئید به هر اسپور مهاجرت می‌کنند، که اگر اسپور تولید شده دارای دو هسته با تیپ آمیزشی مشابه باشد میسلیوم حاصل از تندش آن اسپور، عقیم خواهد بود (ایوانز، ۱۹۵۹).
در قارچ خوراکی تکمه‌ای سفید اغلب بازیدیوسپورها حاوی دو هسته هاپلوئید هستند(پاندی و همکاران، ۱۹۹۴).
بررسی الگوهای چرخه زندگی در A.bisporus
هموتالیسـم:
حدود ۱۰ درصد از قارچهای خوراکی، هموتال هستند. در این قارچها، هیف ناشی از یک اسپور قادر است که تولید اندام باردهی کند و به اصطلاح، خود بارور است. هموتالیسم خود بر دو نوع است:
الف)هموتالیسم اولیه: در اینجا یک هیف ناشی از یک اسپور قادر است که دستخوش یک مرحله ناجور هسته‌ای شدن شود و لذا چرخه جنسی آن کامل می‌شود، مثل volvariella volvacea (پاندی و تو‌اری، ۱۹۹۴).
ب)هموتالیسم ثانویه: در این سیستم، یک اسپور که خود حاوی دو هسته با تیپ آمیزشی متفاوت است می‌تواند تولید یک هیف کند و در نهایت اندامهای باردهی بوجود آید. این سیستم به هموتالیسم کاذب Pseudo homothallism نیز نامیده می‌شود، مثل A.bisporus
(ایمبرنون و همکاران، ۱۹۹۶)

هتروتالیسـم:
حدود ۹۰ درصد از قارچهای خوراکی هتروتال هستند این قارچها خود عقیمند و هیف ناشی از یک اسپور، قادر به تولید اندام باردهی نیست. در این قارچها تلاقی دو هیف ناشی از دو اسپور دارای هسته‌هایی متفاوت از نظر تیپ آمیزشی، برای تکمیل چرخه جنسی لازم است
(پاندی و همکاران، ۱۹۹۴).
میلر در سال ۱۹۷۱ نظریه هموتالیک ثانویه را برای قارچ A.bisporus ارائه داد. اما چرخه زندگی قارچ تکمه‌ای سفید تنها به صورت هموتالیک ثانویه نیست، بلکه درصد اندکی نیز هتروتالیسم می‌باشند، به طوریکه به میزان اندکی نیز بازیدیوم‌های ۳ تا ۴ اسپوره تولید می‌شود که هاپلوئید (n) هستند و عقیم بوده، میوه نمی‌دهند، یا اندک باردهی دارند. قارچهایی را که دارای هر دو نوع اسپور هتروتال و هموتال ثانویه هستند، آمفی تالیسم نامند (زو و همکاران، ۱۹۹۳).

ژنتیک قارچ A.bisporus:
در حالت هموتالیک ثانویه، وقتی دو هسته میوزی هاپلوئید، که از نظر تیپ آمیزشی متفاوت هستند، واردیک بازیدیوسپور می‌شوند، این بازیدیوسپور هیفی را تولید می‌کند، که خود بارور است. وضعیت عمومی آن است که هر کدام از بازیدیومها فقط دو بازیدیوسپور تولید کند. در حالی که در قارچ A.bisporus یک ژن با دو آلل وضعیت هتروکاریوتیکی را کنترل می‌کند (الیوت‌، ۱۹۷۲).  می‌توان در یک بازیدیوسپور آلل آمیزشی یک هسته را به نام Ax و آلل آمیزشی هسته دیگر را    نامید. این دو هسته با هم ترکیب شده و یا یک تقسیم میوز، چهار هسته تولید می‌شود. اگر چهار هسته حاصل از تقسیم میوز را با نام‌های   بنامیم، اسپورهای تولید شده به صورت   خواهند بود. بازیدیوسپورهایی که دارای هر دو آلل   و   هستند، میسلیوم بارور تولید می‌کنند و بازیدیوسپور‌هایی که آلل‌های مشابهی از   یا   دارند، میسلیوم خود عقیم تولید می‌کنند. بنابراین ۶۷/۶۶ درصد از اسپورها، خود بارور و ۳۳/۳۳ درصد آنها، خود عقیم‌اند. اما وضعیت دیگر آن است که از هر بازیدیوم‌‌، ۳ یا ۴ استریگما و متعاقباً ۳ یا ۴ اسپور تولید می‌شود، که اسپورها هر کدام یک هسته میوزی دارند و خود عقیم‌اند. توضیح این که حالات فوق کاملاً تصادفی اتفاق می‌افتد و نسبت‌های فوق تغییر خواهد کرد.
در ۷۵% گونه‌ها هتروتالیک، سازگاری آمیزشی توسط دو سری فاکتور خود ناسازگاری، یعنی فاکتورهای A و B کنترل می‌شود و فاکتورهای A و B به طور مستقل در میوز، جور و تفکیک می‌شوند. در این سیستم، دو لوکوس تیپ آمیزشی، مجزا وجود دارد که برای تولید یک میسلیوم دای‌کاریون، در هر اسپور باید الل‌های مختلفی وجود داشته باشد. در این سیستم چهار تیپ مجزا از
اسپورها بر روی هر بازیدیوم تولید می‌شود و هر اسپور تصادفی از یک نژاد منفرد، فقط با یک چهارم از دیگر اسپورها، سازگار می‌باشد (پاندی و همکاران، ۱۹۹۳).

در میان قارچ‌های خوراکی، کار اصلاحی بر روی قارچ A.bisporus   از همه مشکل‌تر است. در حقیقت مشکلات اصلاحی این قارچ به زیست شناسی خاص آن برمی‌گردد. تا قبل از سال ۱۹۷۰ میلادی، اطلاعات نسبتاً کمی از زیست شناسی قارچ تکمه‌ای سفید در دست بود، لذا تا قبل از سال ۱۹۷۰ کار اصلاحی بر روی آن، براساس گزینش تصادفی بود.
در سال ۱۹۷۱ میلادی میلر و همکاران ثابت کردند که این قارچ در طی چرخه زندگی خود، وضعیت هموتالیک ثانویه دارد. طبق این وضعیت در قارچ تکمه‌ای سفید، سلولهای میسلیوم چندهسته ای هستند(میلر و همکاران، ۱۹۷۱).
در سال ۱۹۷۲ میلادی ریپر و همکاران نظریه میلر را با استفاده از نشانگرهای اگزوتروفیک، ثابت کردند(ریپر و همکاران، ۱۹۷۲).  الیوت و همکاران در ۱۹۷۳ نظریه میلر را با استفاده از آنالیز تتراد ثابت کردند (الیوت و همکاران، ۱۹۷۳).
فیشر و همکاران در سال ۱۹۷۸ میلادی تولید نژادهای   را آغاز کردند، که نقطه عطفی در به نژادی قارچ خوراکی سفید بود. در سال ۱۹۸۹ چنگ و همکاران گزارش کردند که در قارچ تکمه‌ای سفید تندش بازیدیوسپورها بسیار ضعیف و ناهماهنگ است (چنگ و همکاران، ۱۹۸۹).  در سال ۱۹۹۳ میلادی کریگان و همکاران موفق به ترسیم نقشه ژنتیکی این قارچ با استفاده از نشانگرهای مولکولی شدند( کریگان و همکاران، ۱۹۹۳). این قارچ دارای ۱۳ عدد کروموزوم در هر هسته هاپلوئیدی خود است (۱۳= n )طبق گزارش هورگن و همکاران در سال ۱۹۹۳ میلادی، مانع اصلی اصلاح این قارچ، فقدان یک بازیدیوسپور تک هسته‌ای در خلال چرخه زندگی این قارچ است(هورگن و همکاران، ۱۹۹۳).  در قارچ تکمه‌ای سفید غالباً، هر بازیدیوسپور دو هسته‌ هاپلوئید متفاوت از نظر تیپ آمیزشی (هتروکاریون) دارد و تولید بازیدیوسپور تکه هسته‌ای، که ناشی از بازیدیومهای ۳ یا ۴ اسپوری است، بسیار کم است (حدود ۱۰ درصد). این بازیدیوسپورها، میوه نمی‌دهند یا اینکه اندام باردهی بسیار کمی تولید می‌کنند(کریگان و راس، ۱۹۸۷).  کشتهای تک اسپور حاصل از این نوع اسپورها، میسلیوم رویشی تولید می‌کنند که دارای تعدادی هسته با تیپ آمیزشی یکسان هستند. این نوع مسیلیوم  رویشی، هموکاریون نامیده می‌شود که می‌تواند با میسلیوم هموکاریون دیگری که تیپ آمیزشی متفاوت ولی سازگار دارد، جهت تشکیل میسلیوم هتروکاریون، تلاقی انجام دهد.

روشهای بهبود نژادی در قارچ A.bisporus:
۱ـ وارد کردن نژادهای مرغوب: وارد کردن نژادهای مرغوب از کشورهای دیگر، یکی از راههای مستقیم اصلاح قارچ تکمه‌ای سفید است.
۲ـ جمع‌آوری ژرم پلاسمهای وحشی: برخی کشورها از نظر منابع قارچ‌های خوراکی و از جمله قارچ    A.bisporus غنی هستند. برخی از این قارچهای وحشی می‌توانند ژن یا ژن‌های مقاومت به یک یا چند بیماری را به نژادهای موجود انتقال دهند (مهتا و همکاران، ۱۹۹۳).  بوهوس و همکاران در سال ۱۹۵۳ میلادی در مجارستان، آزمایشی را با چند نژاد وحشی قارچ خوراکی در مقیاس بزرگ انجام دادند و مشاهده کردند که نژادهای وحشی دارای تنوع بالایی از لحاظ میزان رشد، تناوب زمان باردهی و کیفیت قارچ هستند.
۳ـ گزینش درون نژادی: از سه طریق می‌توان به این امر دست یافت: کشت بافت، کشت تک اسپوری، کشت چند اسپوری.
۴ـ دورگ‌گیری: هدف از دورگ‌‌گیری، گرد هم آوردن شاخص‌های مطلوب ژنتیکی از نژادهای مختلف و تولید یک ژرم پلاسم جدید است.
۵ـ تلاقی هدفمند هموکاریون‌ها:
۶ـ مهندسی ژنتیک:

کشت بافت:
اولین گزارشات در مورد کشت بافت به دهه ۱۹۴۰ میلادی باز می‌گردد که کلیگمن استفاده از کشت بافت قارچ‌هایی با ظاهر و مرفولوژی مطلوب را به دلیل داشتن میوه‌دهی و عملکرد بالا پیشنهاد کرد (کلیگمن‌، ۱۹۴۰).  مهتا و همکاران در سال ۱۹۹۴ گزارش کردند که کشت بافت از کلاهک یا پایه قارچ خوراکی تکمه‌ای سفید گرفته می‌شود. برای انجام کشت بافت از کلاهک تازه، ابتدا کلاهک با استفاده از هیپوکلریت سدیم یک درصد، به مدت پنج دقیقه ضدعفونی می‌شود سپس نمونه‌هایی از قسمتهای درونی بافت کلاهک انتخاب و به محیط کشت منتقل می‌شود. نگهداری کشت‌ها در دمای   درجه سانتیگراد صورت می‌گیرد. پس از چند روز، میسلیوم‌ها در سطح محیط کشت دیده می‌شوند.

گزینش از طریق کشت تک اسپوری:
ابتدا، نحوه بدست آورن اسپور از قارچ تکمه‌ای سفید توضیح داده می‌شود و سپس نحوه کشت تک اسپور، شرح داده خواهد شد.

تهیه نقش اسپور:
طبق گزارش رویز و همکاران در سال ۱۹۸۲ میلادی کلاهک جوانی که پرده زیر آن کشیده شده است، اما هنور باز نشده است، انتخاب و تمیز می‌شود. سپس پایه زیر کلاهک را جدا کرده و کلاهک در یک بشر سترون شده (استریل) که حاوی یک کاغذ صافی است، قرار داده می‌شود. پس از حدود ۷۲ ساعت، کاغذ صافی که حاوی اسپور است، را به نوارهایی تقسیم می‌کنند و این نوارها را در لوله‌های پلاستیکی ۵ میلی لیتری در یخچال نگهداری می‌کنند. همچنین نقش اسپور در روی کاغذ صافی را می‌توان در یخچال برای استفاده بعدی، نگهداری کرد(رویز و همکاران، ۱۹۸۲).

الف ـ کشت و گزینش تک اسپوری:
هورگن و همکاران در ۱۹۸۹ میلادی گزارش کردند که تندش بازیدیوسپورهای قارچ A.bisporus با مشکل کندی تندش و همچنین متغیر بودن فرایند تندش و آلودگی روبرو است (هورگن و همکاران، ۱۹۸۹).  آنها ابتدا تراکم اسپور در مایع تعلیقی تهیه شده را با استفاده از یک هموسایتومتر برای تراکم اسپور ۱۰۰ هزار در میلی‌لیتر تنظیم کردند. سپس ۲۰ هزار اسپور در داخل هر ظرف پتری حاوی محیط غذایی PDA (Popato Dexterose Agar) قرار داده شد برای تحریک تندش بازیدیوسپورها، در یک طرف پتری قطعه‌ای از میسلیوم قارچ A.bisporus قرار داده می‌شود. بعد از ۱۴ـ۳ روز، تک اسپورهای تندش کرده را جدا کرده و به محیط کشت جدید منتقل کردند. تک اسپورها از نظر سرعت رشد، شکل اندام تولیدمثلی، باروری و عملکرد تنوع داشتند. با استفاده از این شیوه، نژادهای تجاری بسیاری با عملکرد قابل قبول تولید شده است. در مرکز ملی تحقیقات قارچ خوراکی در هند، تک اسپورهای زیادی از نژادهای مختلف جدا شده است. این تک اسپورها براساس شاخص‌های رشد میسلیومی، نحوه رویش اسپاون در بستر کشت، عملکرد و شاخص‌های اندام باردهی گزینش شده‌اند میسلیوم‌هایی که به صورت رشته‌ای رشد کرده‌اند، گزینش شده‌اند، و از ‌آنها اسپاون تهیه می‌شود. سپس آزمایشات میوه‌دهی در حجم کم انجام می‌شود و در نهایت آزمایشات میوه‌دهی تکرار دار، در حجم بزرگ، برای ارزیابی دقیق تک اسپورها صورت می‌گیرد
(پاتاک و همکاران، ۱۹۹۸).

ب ـ کشت و گزینش چنداسپوری:
مهتا و همکاران در ۱۹۹۴ میلادی گزارش کردند که گزینش چند اسپوری، یکی از قدیمی‌ترین و راحترین روشهای گزینش برای قارچ A.bisporus بوده است (مهتا و همکاران، ۱۹۹۴).  کشت چند اسپوری مشابه با کشت تک اسپوری است. طبق گزارش پاتاک و همکاران در سال ۱۹۹۸ می‌توان از تراکم‌های بین ۵۰ هزار تا ۲۰۰ هزار اسپور در هر میلی‌لیتر استفاده کرد و برای هر پتری ۲۰ هزار اسپور در نظر گرفت. اسپورها از روز سوم شروع به تندش می‌کنند و سایر مراحل کشت چند اسپوری، مشابه با کشت تک اسپوری است. از یک هفته بعد از کشت چند اسپوری، گزینش را براساس همان معیارهایی که در کشت تک اسپوری توضیح داده شد، انجام می‌گیرد.
هنگامی که هدف از گزینش، بازیابی عملکرد یک نژاد مشخص است، گزینش با استفاده از کشت تک اسپوری و چند اسپوری سودمند است. پس این روشها فقها باعث کشف و حفظ نوترکیبی‌ها درون یک نژاد می‌شوند و لذا برای رسیدن به یک نژاد با شاخصهای ژنتیکی مطلوب و در نهایت با عملکرد بالا، باید از روشهایی که بعداً اشاره می‌شود استفاده کرد و روشهای گزینش تک اسپور و چند اسپوری تا حدودی تنوع درون یک نژاد را نشان می‌دهند.

قیمت : 5000 تومان
لینک کوتاه این پروژه : http://lonadoc.com/?p=7556
فرمت فایل : word
تعداد صفحات : 85 صفحه
کليک جهت خريد کالا ، به منظور پذيرش قوانين و مقررات سايت مي باشد .
ipmg
برچسب‌ها : ، ، ، ، ، ، ، ، ، ، ، ، ، ، ، ، ، ، ، ، ، ، ، ، ،


شما هم می توانید دیدگاه خود را ثبت کنید

- کامل کردن گزینه های ستاره دار (*) الزامی است
- آدرس پست الکترونیکی شما محفوظ بوده و نمایش داده نخواهد شد

سلام دنیا!
پروژه های حسابداری
پروژه روان شناسی
اخبار انگلیسی با متن